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雙擎驅(qū)動 洞見多維 | 基于CytoFLEX mosaic的40色全光譜免疫表型分析方案
貝克曼庫爾特生命科學(xué)研究團(tuán)隊(duì)成功將40色全光譜流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用于人外周血免疫細(xì)胞的深度表型分析，進(jìn)一步拓展了高維流式在免疫研究中的應(yīng)用邊界。該方案基于經(jīng)典OMIP-69[1,2]面板進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)合CytoFLEX LX流式細(xì)胞分析儀和CytoFLEX mosaic 88光譜檢測模塊，實(shí)現(xiàn)了對CD4?/CD8? T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等關(guān)鍵免疫群體的精準(zhǔn)識別與功能分析。
實(shí)驗(yàn)采用專有的混合泊松算法，有效降低光譜重疊干擾，確保信號解析的精準(zhǔn)度，實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)健的光譜解析，為復(fù)雜免疫圖譜的構(gòu)建提供了可靠工具。本研究證明了CytoFLEX mosaic在適配已發(fā)表panel方面的可靠性和靈活性，有助于快速、標(biāo)準(zhǔn)化地實(shí)施復(fù)雜的免疫表型分析，減少設(shè)置時間并最大限度地減少操作不一致性。
熒光染料選擇與方案設(shè)計
本方案中選擇的大多數(shù)熒光染料基于先前發(fā)表的OMIP-69中所使用的染料，進(jìn)行的替換主要是由于抗體的可獲得性。值得注意的是，我們加入了RealBlue?（熒光染料，這些染料在原始方案設(shè)計時不可用，用以替代性能稍差的熒光團(tuán)。這些替換經(jīng)過仔細(xì)選擇，以在最小化對整體性能影響的前提下，保持方案的完整性（圖1）。使用相似性指數(shù)（圖2）對具有獨(dú)特發(fā)射光譜的熒光染料進(jìn)行了量化。相似性指數(shù)≤ 0.98的熒光染料對被認(rèn)為足夠獨(dú)特，可以共同使用。
為確保熒光染料之間的兼容性，我們使用了復(fù)雜度指數(shù)，該指數(shù)測量了熒光染料之間的累積光譜干擾，同時考慮了溢出和自發(fā)熒光效應(yīng)。較低的復(fù)雜度指數(shù)表明光譜重疊減少，解析數(shù)據(jù)的分辨率提高。最終方案的復(fù)雜度指數(shù)低至40.3。
熒光染料對中具有相似光譜的，如BB515/FITC、BV421/SuperBright436和Alexa Fluor 647/SparkNIR 685，被包含在方案中，并通過選擇合適的標(biāo)志物、調(diào)整抗體用量以及使用泊松混合解析算法來謹(jǐn)慎管理，以減少信號重疊。
選擇ViaKrome 808進(jìn)行活性評估是因?yàn)槠洫?dú)特的近紅外光譜特征，這最大限度地減少了與其他熒光染料的干擾，使其與多色流式細(xì)胞術(shù)方案廣泛兼容。
圖1：40種熒光染料的光譜特征。所有光譜均已歸一化至峰值通道以便直接比較，并使用CytExpert for Spectral軟件進(jìn)行可視化
圖2：相似性指數(shù)。解析矩陣在設(shè)門于細(xì)胞的樣本上制備，并用于解析40色多色樣本。本方案中使用的選定熒光染料的相似性指數(shù)，其復(fù)雜度得分為40.3，使用CytExpert for Spectral軟件生成
設(shè)門策略與數(shù)據(jù)分析
圖3解釋了如何使用手動設(shè)門來識別主要細(xì)胞群體。所有預(yù)期的細(xì)胞群和表型均被準(zhǔn)確檢測到。
圖4顯示了通過優(yōu)化活/死染色前的洗滌條件改善CXCR3和CXCR5染色。
為了分析復(fù)雜的免疫譜數(shù)據(jù)，我們采用了Cytobank分析平臺上降維和聚類算法的分析流程。fcs文件使用混合泊松解析算法進(jìn)行預(yù)處理，然后上傳到Cytobank平臺云端進(jìn)行分析。
圖5：使用t-SNE-CUDA降維進(jìn)行基于機(jī)器學(xué)習(xí)的血細(xì)胞分析。A) 每個圖譜按單個標(biāo)志物通道著色，顏色強(qiáng)度標(biāo)尺（顯示在每個圖的右側(cè)）代表相應(yīng)標(biāo)志物的相對表達(dá)水平。 B) 密度圖提供了六名供體中觀察到的獨(dú)特模式的可視化表示。
圖6：FlowSOM聚類與手動設(shè)門群體的對比
結(jié)論
本研究成功對40色OMIP-69方案進(jìn)行了精簡與優(yōu)化，使其適用于高通量免疫表型分析，能夠全面解析主要免疫細(xì)胞亞群。數(shù)據(jù)采集在配備CytoFLEX mosaic 88光譜檢測模塊的CytoFLEX LX流式細(xì)胞儀上完成，該平臺以其高分辨率和靈活性，實(shí)現(xiàn)了全光譜檢測性能。通過混合泊松算法進(jìn)行光譜解析，有效降低了發(fā)射光譜重疊帶來的干擾，確保了信號的精準(zhǔn)分離。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，解析出的細(xì)胞群體與參考文獻(xiàn)1高度一致，并通過設(shè)門策略成功驗(yàn)證了解析效果與表型識別的準(zhǔn)確性。
為深入挖掘此高維數(shù)據(jù)集的價值，我們進(jìn)一步應(yīng)用了t-SNE（CUDA加速的）降維與FlowSOM無監(jiān)督聚類功能。在Cytobank平臺上，這些算法即便使用默認(rèn)設(shè)置，也能實(shí)現(xiàn)與手動設(shè)門相媲美的免疫群體自動識別，提供了一種更客觀、可擴(kuò)展的分析方案。
綜上所述，CytoFLEX mosaic光譜流式分析儀結(jié)合本分析流程，充分展現(xiàn)了其在高效實(shí)施復(fù)雜多色方案方面的強(qiáng)大能力，僅需最小化優(yōu)化即可獲得可靠數(shù)據(jù)。
參考文獻(xiàn)
[1] Park LM, Lannigan J, Jaimes MC. OMIP-069: Forty-color full spectru flow cytometry panel for deep immunophenotyping of major cell subsets in human peripheral blood. Cytometry A 2020;97:1044-51.
[2] Park LM, Lannigan J, Low Q, et al. OMIP-069 version 2: Update to the 40-color full spectrum flow cytometry panel for deep immunophenotyping of major cell subsets in human peripheral blood. Cytometry A 2024;105:791-9.
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