我們知道流式實驗中抗體標(biāo)記的數(shù)量越多得到的信息就越詳細(xì)和準(zhǔn)確，以此同時，實驗操作也變得更加復(fù)雜。多色流式實驗中的補償操作，一直以來都是流式使用者非常關(guān)心的問題。甚至有人認(rèn)為，由于目前熒光染料的光譜普遍比較寬，可能會在相鄰的多個通道都造成比較大的干擾，因此很難在流式上完成超過18色以上的實驗。事實是否真是這樣呢？恰巧哈佛醫(yī)學(xué)院附屬麻省總醫(yī)院的Dr. Ravi Mylvaganam與我們分享了他在6激光21色的CytoFLEX LX上做的一個多色實驗。我們一起來看看。

Dr. Ravi Mylvaganam采用20個熒光抗體以及一個細(xì)胞死活染料組成21色的panel，可同時檢測多群記憶、效應(yīng)T細(xì)胞，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，NK細(xì)胞甚至是干細(xì)胞樣T細(xì)胞等細(xì)胞亞群，詳細(xì)的抗體和染料標(biāo)記如下所示：

實驗樣本準(zhǔn)備步驟：
1. 標(biāo)記一個樣本管，在管中添加3 µL以下抗體：

• 1) CD3 BUV395
• 2) CD19 BUV496
• 3) CD56 BUV737
• 4) CD25 BV605
• 5) CD95 BV650
• 6) CD38 BV786
• 7) CD16 PerCP
• 8) CD4 PerCP-eFluor710
• 9) CCR4 PE-TexasRed
• 10) CCR7 PC7
• 11) CD8 AF790

2. 添加25 µL Brilliant Stain Buffer，渦旋混勻4秒；然后加入100 µL全血，再次渦旋混勻4秒后，在37ºC下避光孵育20分鐘
3. 在試管中添加5 µL以下抗體：

• 1) CD57 Pacific Blue
• 2) CD45 Krome Orange
• 3) CD45 RA FITC
• 4) CCR6 PE
• 5) CD14 PC5
• 6) PD-1 (CD279) PC5.5
• 7) CD27 APC
• 8) CD127 APC-A700
• 9) CD28 APC-A750

4. 渦旋混合試管4秒后室溫避光孵育20分鐘
5. 在管中添加1 mL VersaLyse裂解液，渦旋混合2～3秒，室溫下避光孵育15分鐘
6 樣本200g離心5分鐘，棄去上清液
7. 在試管中添加5 µL IR Fixable染料，渦旋混合2～3秒，室溫下避光孵育20分鐘
8. 添加2 mL PBS重懸細(xì)胞，200g離心處理試管5分鐘，棄去上清液
9. 添加0.9 ml PBS和0.1 ml IOTest3固定液重懸細(xì)胞，可準(zhǔn)備上機(jī)檢測
10. 同時按照上述的孵育、離心操作制備單染管

 

實驗結(jié)果如下

從實驗結(jié)果圖可以看出，這個21色方案的結(jié)果分群清晰，不論是常規(guī)的CD3+CD4+Th細(xì)胞還是含量較低的Treg或者干細(xì)胞樣T細(xì)胞，都能很好的檢測到，看來對于CytoFLEX LX而言，21色實驗也不是一個難題。如果您需要該方案詳細(xì)的信息，可與我們聯(lián)系。

多色補償問題的簡化，與流式細(xì)胞儀技術(shù)的發(fā)展密切相關(guān)。遙想小編當(dāng)年，那個流式細(xì)胞儀用完后還要用紅布蓋起來的年代，我剛開始接觸的是一臺4色的流式，當(dāng)時4色實驗就是“多色”實驗了！那時沒有離線補償也沒有自動補償，流式也沒做得那么頻繁，調(diào)補償是相當(dāng)刺激的操作：先在17寸顯示屏上畫滿所有通道兩兩對應(yīng)的散點圖，上樣之后一定要眼疾手快反應(yīng)迅速默念“橫平豎直”，如果相關(guān)的門沒圈好，或者看到補償矩陣nao zi蒙圈不知道調(diào)哪里，一著急就手足無措，經(jīng)常一管單染管跑完補償還沒調(diào)好所以實驗前師兄師姐往往要提醒“單染管多準(zhǔn)備點樣本”……

現(xiàn)在儀器的補償操作相比以前，我的天，簡直不要好太多！

拿這個做21色方案的CytoFLEX LX舉個栗子：

首先，它可以自動調(diào)補償，用戶只需要把單染管全跑一遍，圈好相應(yīng)的陰陽性細(xì)胞群，點擊計算補償就OK了，無論是2色還是21色都是這么簡單的操作。畫一堆圖看橫平豎直？不存在！

其次，它可以離線調(diào)補償。樣本比較多，想測完再拷回去慢慢分析？沒問題！

然后，CytoFLEX LX有補償庫功能，只要是做過的染料就可以把這個染料的補償信息存到庫里，以后做實驗可以直接讀取，避免需要重復(fù)做單染管的煩惱。 后，這個是的技能，方案里調(diào)好的補償會根據(jù)后續(xù)電壓的調(diào)整而自動調(diào)整。也就是說，以后做完補償，跑樣本時發(fā)現(xiàn)某個通道的電壓如果再調(diào)一點就了，如果是以前或其他儀器，您需要調(diào)整電壓后再重新調(diào)補償，而現(xiàn)在在CytoFLEX LX 上，您直接調(diào)電壓就好了！

其實很簡單， 其實很自然，多色的補償并沒有那么難！雖然補償?shù)牟僮鞲悄芑?，但目前多色實驗中抗體和染料的選擇以及樣本的處理仍然是一門學(xué)問。如果您需要了解多色實驗更多的信息，比如染料的搭配和選擇，以及樣本處理的方法，您也可以聯(lián)系貝克曼公司索取資料。

* CytoFLEX LX流式細(xì)胞儀僅用于科研，不用于臨床診斷。